人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒

使用說明書

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒基本原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人TNFSF14抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的人TNFSF14與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人TNFSF14抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗人TNFSF14抗體與結合在包被抗體上的人TNFSF14結合、生物素與親和素特異性結合而形成**復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，人TNFSF14濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中人TNFSF14的濃度。

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒描述:

試劑盒組成：

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒檢測前準備工作:

1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。

3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為8000pg/mL）。然后根據需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品：取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。

當日使用。

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據實際用量來稀釋，如200μL/管）

1. 在各孔中加入標準品或樣品各100μL， 37℃孵育90分鐘

2. 加入100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘

3. 洗滌3次

4. 加入100μL酶結合物工作液， 37℃孵育30分鐘

5. 洗滌5次

6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分鐘左右

7. 加入50μL終止液，立即在450nm波長處測量OD值

8. 結果計算

一、操作因素對ELISA結果的影響ELISA操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。

1.加樣

2.溫育

3.洗滌

4.顯色

5.比色

二、灰區的設置通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性**測定結果報告的依據。

三、標本復查ELISA手工檢測過程復雜，影響因素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成結果的差異，因此加大復查力度是保證結果準確性的可靠方法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及少見模式的檢測結果進行復查。

四、結果判斷和報告常用下列幾種方法表示結果：

1.定性測定

2.半定量測定 結果一般以滴度表示。

3.定量測定 即用已知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標準曲線，結果以**量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應板都必須繪制相應的標準曲線。

注意事項：

A 仔細閱讀說明書。

B 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。

C 按說明書確定所有試劑齊全（數量、體積）。

D 標本制備要規范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內無法實驗者，注意低溫保存。

E 準備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標儀）。

F 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據檢測標本數量確定所需試劑的量。

G 檢查試劑盒內每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內說明書推薦的條件存儲。

H 檢查不穩定或者變質的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標準品稀釋液或者檢測稀釋液，可能在設計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標板之前，必需不停攪拌。

I 保證充分的孵育時間和溫度。

J 切勿使用不同生產批號的試劑取代現有試劑或混合現有試劑。

K 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產生。

L 在實驗開始之前，安排好實驗流程。

M 在實驗開始之前，清潔工作臺。

N 若有問題，應與我公司或代理商的技術支持聯系

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒結果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。

2. 推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。 

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒有效期穩定性考察

本試驗以腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)為例

1.  OD值：

正常保存條件下有效期內和超過有效期2個月所測OD值比較

正常有效期內OD值： 3.251，2.845，2.126, 1.859, 1.463, 1.022, 0.710, 0.08

超過2個月有效期OD值：3.1.7, 2.643, 2.125, 1.796, 1.453, 0.876, 0.432, 0.07

2.回收率：分別于定值血清及血漿中加入一定量的腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)標準品，重復測定并計算其品均值，回收率為測定值與理論值的比率。

        正常保存條件下有效期內和過有效期2個月elisa 試劑盒回收率檢測結果

3. 線性：分別于定值血清及血漿中加入一定量的腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)標準品，并將標本按1:2,1:4,1:8稀釋，線性范圍即為稀釋后樣本中腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)含量的測定值與理論值的比率。

         正常保存條件下有效期內和過有效期2個月elisa 試劑盒回線性檢測結果

4.  精密度：以樣品測定值的變異系數CV表示。CV（%）=SD/meanx100

批內差：取同一批次試劑盒對低值，中值和高值樣本進行定量檢測，每份樣本測定20次，分別計算不同濃度樣本的平均值和SD值。

批間差：選取 3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定， 每個樣本使用同一試劑盒重復測定 8 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。(批內差： CV<10%;批間差： CV<11%)

       正常保存條件下有效期內和過有效期2個月elisa 試劑盒回精密度檢測結果

                    Intra-assay precision

人腫瘤壞死因子配體超家族成員14(TNFSF14)試劑盒會出現的問題及解決辦法：

1. 加入反應終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶標記物。

解決辦法：請按照操作步驟進行。

b.原因：試劑盒內容物未能充分回。

解決辦法：確定試劑盒內容物回溫后再進行操作。

c.原因：室溫太低。

解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當延長溫育時間。

d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。

解決辦法： 請用試劑盒內所提供的清洗液清洗。

e.原因：試劑盒已過有效期限。

解決辦法：請更換成仍在有效期限內的試劑盒。

2. 標準曲線線性不佳，或是平行性不好。

a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。

解決辦法： 請確認溫育位置既不透光也不透風(如抽屜內)。

b.原因：操作時間拖太久。

解決辦法：請在方法熟練后再進行操作。

c.原因：微孔間相互污染。

解決辦法： 加樣品時，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：標準品或酶標記物所加入的量不一致。

解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。

e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。

解決辦法：加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。

f.原因：洗板過程發生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進行下一步驟)。

解決辦法：請隨時監控洗板機洗板過程，洗完后立即進行下一步驟。

3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。

a.原因：室溫太高(>25℃)。

解決辦法： 若無法降低室內溫度，請適當縮短步驟4的溫育時間。

b.原因：底物溶液受到污染。

解決辦法： 若發現底物溶液已呈現淡藍色，請不要再使用。

c.原因：反應時間超過太久。

解決辦法：請控制反應時間。

d.原因：酶標記物污染了盒內其它試劑。

解決辦法：使用過的吸頭應立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標記物與底物溶液)接觸過的容器應立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)

4. 陰性標準品的吸光值低于陽性標準品的吸光值。

a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。

解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。

b.原因：洗板過程發生問題(同2-f.)。

解決辦法：請參考2-f.

c.原因：添加樣品或酶標記物的量不一致。

解決辦法： 請參考2-d.

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